問題詳情：
熒光蛋白（GFP）在紫外光下會發出綠*熒光，某科研團隊將GFP基因*入質粒P中構建了重組質粒載體P0，用於基因工程中基因表達載體（P1）的篩選和鑑定。部分過程如下圖所示，下表爲部分限制酶的識別序列及切割位點。回答問題：
（1）過程①中用EcoRV酶切獲得的目的基因具有_________末端，過程②表示利用PCR技術擴增目的基因，前提是要根據_________設計出引物，此外還需在引物的一端加上_________序列，以便於P1的構建和篩選。
（2）過程③中，質粒P0需用限制酶_________切割，才能與擴增出的目的基因在_________酶作用下形成P1。
（3）爲了篩選出含有質粒P1的菌落，需採用添加_________的培養基平板進行培養，在紫外光激發下_________的菌落，即爲含有P1的菌落。
（4）提取經上述篩選所得菌落的RNA，透過_________獲得DNA，再進行PCR擴增，若最終未能檢測出目的基因，可能的原因是__________。
【回答】
平 一段已知目的基因的核苷*序列 GATC BamHⅠ DNA連接 四環素 不發出綠*熒光 逆轉錄（反轉錄） 目的基因未能在受體菌中轉錄
【分析】
基因工程技術的基本步驟：
（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。
（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啓動子、終止子和標記基因等。
（3）將目的基因匯入受體細胞：根據受體細胞不同，匯入的方法也不一樣。將目的基因匯入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因*法和花粉管通道法；將目的基因匯入動物細胞最有效的方法是顯微注*法；將目的基因匯入微生物細胞的方法是感受態細胞法。
（4）目的基因的檢測與鑑定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染*體的DNA是否*入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術。個體水平上的鑑定：抗蟲鑑定、抗病鑑定、活*鑑定等。
【詳解】
（1）從表格中看出用EcoRV酶切獲得的目的基因具有平末端；PCR擴增目的基因，需要根據一段已知目的基因的核苷*序列設計出引物；構建P1時，限制酶Sau3AⅠ會破壞四環素抗*基因（標記基因），所以只能選擇BamHⅠ，還需要在引物的一端加上GATC序列。
（2）根據（1）的分析，限制酶Sau3AⅠ會破壞四環素抗*基因（標記基因），而EcoRV酶破壞複製原點，所以需要用擇BamHⅠ酶進行切割，切割後的目的基因在連接酶的作用下形成P1。
（3）爲了篩選含有質粒P1的菌落，由於標記基因是四環素抗*基因，所以需採用添加了四環素的培養基平板進行培養在紫外光激發下，由於使用BamHⅠ酶破壞了GFP基因，所以選擇不發綠*熒光的菌落，即爲含有P1的菌落。
（4）所得菌落的RNA透過逆轉錄（反轉錄）獲得DNA，再進行PCR擴增；若最終未能檢測出目的基因，可能的原因是目的基因未能在受體菌中轉錄。
【點睛】
本題考查基因工程的基本步驟，難點是根據質粒的結構選擇合適的限制酶。識記運載體的特點即可解答。
知識點：基因工程
題型：綜合題
