問題詳情：
圖1是某基因工程中構建重組質粒的過程示意圖，載體質粒P0具有四環素抗*基因（tetr)和氨苄青黴素抗*基因（ampr）。請回答下列問題：
（1）EcoRV酶切位點爲
，EcoR V酶切出來的線*載體P1爲___________末端。
（2）用TaqDNA聚合酶進行PCR擴增獲得的目的基因片段，其兩端各自帶有一個腺嘌呤脫氧核苷*。載體P1用酶處理，在兩端各添加了一個鹼基爲___________的脫氧核苷*，形成P2；P2和目的基因片段在__________酶作用下，形成重組質粒P3。
（3）爲篩選出含有重組質粒P3的菌落，採用含有不同抗生素的平板進行篩選，得到A、B、C三類菌落，其生長情況如下表（“+”代表生長，“﹣”代表不生長）。根據表中結果判斷，應選擇的菌落是__________（填表中字母）類，另外兩類菌落質粒匯入情況分別是_____、________________。
（4）爲鑑定篩選出的菌落中是否含有正確*入目的基因的重組質粒，擬設計引物進行PCR鑑定。圖2所示爲*、乙、*3條引物在正確重組質粒中的相應位置，PCR鑑定時應選擇的一對引物是__________。某學生嘗試用圖中另外一對引物從某一菌落的質粒中擴增出了400bp片段，原因是_______________。
【回答】
平 胸腺嘧啶（T） DNA連接 B A類菌落含有P0 C類菌落未轉入質粒 乙* 目的基因反向連接
【解析】
【分析】
基因表達載體的基本結構包括複製原點、目的基因、標記基因、啓動子、終止子等。根據題幹資訊和圖形分析，P0是載體質粒，其含有的氨苄青黴素抗*基因（ampr）和四環素抗*基因（tetr）都屬於標記基因，可用於檢測目的基因是否匯入受體細胞；EcoRV酶爲限制酶，其切割質粒後會破壞四環素抗*基因（tetr）。
【詳解】
（1）根據題意分析，EcoRV酶識別的序列是-GATATC-，並且兩條鏈都在中間的T與A之間進行切割，因此其切出來的線*載體P1爲平末端。
（2）依題意並據圖分析，目的基因兩側爲黏*末端，且露出的鹼基爲A，則在載體P1的兩端需要各加一個含有鹼基T的脫氧核苷*，以便形成具有黏*末端的載體P2，再用DNA連接酶將P2與目的基因連接起來形成重組質粒P3。
（3）根據以上分析已知，限制酶（EcoRV酶）切割後破壞了四環素抗*基因，但是沒有破壞氨苄青黴素抗*基因，因此含有重組質粒P3的菌落在含有四環素的培養基中應該不能生長，而在含有氨苄青黴素的培養基中能生長，結合表格分析可知，應該選擇B類菌落。根據表格分析，A類菌落在氨苄青黴素和四環素的培養基中都能夠生長，說明其匯入的是P0；C類菌落在任何抗生素的培養基中都不能生長，說明其沒有匯入任何質粒。
（4）據圖分析，根據目的基因*入的位置和PCR技術的原理分析，PCR鑑定時應該選擇的一對引物是乙和*；根據題意和圖形分析，某同學用圖中的另外一對引物（*、乙）從某一菌落的質粒中擴增出了400bp的片段，說明其目的基因發生了反向連接。
【點睛】
解答本題的關鍵是識記並理解基因工程的四個基本步驟，尤其是對核心步驟——構建基因表達載體步驟的理解，明確基因表達載體的幾個必須的成分及其作用，進而結合題幹要求分析答題。
知識點：基因工程
題型：填空題
